Next generation sequencing technologies
+Encontramos aquí la pirosecuenciación o 454 life sciencies. Se fragmenta el DNA de interés (o no, según tamaño). A los fragmentos
se les unen unas secuencias muy cortas. Estas secuencias son los adaptadores
que incluyen una secuencia complementaria al primer que se va a añadir
posteriormente y sirven para unir a unas bolas. Se seleccionan las bolitas que
tienen una sola secuencia en 3’ unida. Cada bolita es un medio acuoso con lo
necesario para hacer una PCR de forma que se hace una PCR por cada microgota de
las bolitas que tienen una secuencia unida. De esta forma cada bolita va a
tener millones de copias idénticas. Hay que seleccionar las bolas que tienen
muchas secuencias porque puede que haya habido algún fallo. Todas esas bolas se
ponen en unos nanopocillos de forma que solo cabe una bolita por pocillo. De
esta forma se van a tener millones de pocillos, con una bolita y con miles de
secuencias amplificadas de cada secuencia.
(Imagen tomada de Wikipedia)
Se añade un nucleótido y cuando une, se desencadena una reacción de
forma que se libera pirofosfato y se libera una luz que se va a detectar. Se
van a iluminar los pocillos que tengan cada nucleótido.
Los nucleótidos se añaden secuencialmente por lo que sabemos a que
corresponde cada una de las luces. Según la secuencia y la cantidad de
nucleótidos añadidos. Puede haber problemas de inserciones. Por eso, hay que
mapear varias secuencias.Se
puede usar para analizar el transcriptoma, para poder coger todas las fases de
lectura
+SOLID: el proceso inicial es igual: se fragmentan las
secuencias y se unen los adaptores para unirse a las bolas que son específicas
para una sola secuencia. Se hace PCR y se obtiene un tamaño de una micra. La reacción se secuenciación es pos ligación:
en vez de añadir un nucleótido se añade un fragmento de 8 nucleotido. Este
fragmento consta de: dos nucleótidos específicos, tres degenerados y tres que
comprenden todas las posibilidades. Después se une al fluoroforo. Se hibridan los dos primeros y los tres
siguientes van a dar fortaleza para mantener esto unido. Cuando esto está
unido, sabemos que en la secuencia que tenemos, las dos primeras corresponden
con nuestro oligonucleótido construido. De esta forma, cada base se está
secuenciando dos veces con el fluoroforo de antes y el de después. De esta
forma, una misma secuencia esta mapeada con dos fluoroforos y muchas veces de
forma que se está seguro de que esa secuencia es así. Esto es útil para hacer
haplotipos y localizar SNPs.
(Imagen tomada de http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=10 )
Ahora se hace un tratamiento quimico que elimina el
fluoroforo y los nucleótidos al azar. De esta forma, tenemos nuestros dos
nucleótidos de interés y tres nucleótidos degenerados. El problema es que como
estamos secuenciando dos a dos, hay problemas cuando faltan dos pb.
+Illumina: es la más usada. No necesita unirse a una
bola y no se hace una PCR de emulsión (en aceite). La secuencia se une a una
placa de secuenciación de tal forma que reconoce un adaptador al azar. Al tener
una secuencia complementaria, se forma un puente y se une a otro adaptador.
Esto se elonga en una PCR de forma que tenemos dos cadenas de una secuencia
localizadas en una región concreta. Se separa el puente y se tienen dos
secuencias iguales. Se suelen formar clusters de secuencias únicas a lo largo
de toda la placa. Esta tecnología se
basa en unos terminadores reversible de forma que una vez medida la
fluorescencia, se puede eliminar.
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| Imagen de http://seqanswers.com/forums/images/content/ilmn-step1-6.jpg |
Y se iniciaría el siguiente ciclo de secuenciación. El
problema es que aparezcan sustituciones. Es el más usado y el más barato en
coste pero no sirve del todo bien para el transcriptoma.
Third
generation sequencing technologies
+Ion Torrent: no va en base a fluorescencia.
Esta basada en la química. No se va a identificar la luz de un fluoroforo cada
vez que se incorpora a la secuencia si no que se va a ver un cambio de pH. Se
añade nucleótido y se libera un protón
por cada nucleótido y n veces por cada secuencia en cada bola. Por lo
tanto, la diferencia de pH es lo que se va a medir. Esta diferencia de pH lo
detecta un sensor que genera una diferencia de potencial. Después de medir la
química, se hace un lavado y se empieza de nuevo. Esto se ha usado mucho para
la secuencia de novo, resecuenciación, paleogenomica, transcriptoma, análisis
de variabilidad genética, epigenetica, regulación génica a gran escala.
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| Imagen de http://www.iontorrent.com/lib/images/step1.jpg |
