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miércoles, 18 de enero de 2012
domingo, 15 de enero de 2012
Así será la "tormenta solar catastrófica" - Medio Ambiente - Diario digital Nueva Tribuna
Lo ponto también en mi Blog porque creo que es algo muy importante y como en este país no nos van a informar de absolutamente nada, así hay la mayor difusión
Así será la "tormenta solar catastrófica" - Medio Ambiente - Diario digital Nueva Tribuna
Así será la "tormenta solar catastrófica" - Medio Ambiente - Diario digital Nueva Tribuna
jueves, 12 de enero de 2012
miércoles, 28 de diciembre de 2011
Seminario Nuevas Técnicas de Secuenciación del DNA. Raquel López Díez. Facultad Biología UAM
Estos son mis apuntes del Seminario impartido por Raquel López Díez sobre las nuevas técnicas de secuenciación.
Next generation sequencing technologies
+Encontramos aquí la pirosecuenciación o 454 life sciencies. Se fragmenta el DNA de interés (o no, según tamaño). A los fragmentos
se les unen unas secuencias muy cortas. Estas secuencias son los adaptadores
que incluyen una secuencia complementaria al primer que se va a añadir
posteriormente y sirven para unir a unas bolas. Se seleccionan las bolitas que
tienen una sola secuencia en 3’ unida. Cada bolita es un medio acuoso con lo
necesario para hacer una PCR de forma que se hace una PCR por cada microgota de
las bolitas que tienen una secuencia unida. De esta forma cada bolita va a
tener millones de copias idénticas. Hay que seleccionar las bolas que tienen
muchas secuencias porque puede que haya habido algún fallo. Todas esas bolas se
ponen en unos nanopocillos de forma que solo cabe una bolita por pocillo. De
esta forma se van a tener millones de pocillos, con una bolita y con miles de
secuencias amplificadas de cada secuencia.
(Imagen tomada de Wikipedia)
Se añade un nucleótido y cuando une, se desencadena una reacción de
forma que se libera pirofosfato y se libera una luz que se va a detectar. Se
van a iluminar los pocillos que tengan cada nucleótido.
Los nucleótidos se añaden secuencialmente por lo que sabemos a que
corresponde cada una de las luces. Según la secuencia y la cantidad de
nucleótidos añadidos. Puede haber problemas de inserciones. Por eso, hay que
mapear varias secuencias.Se
puede usar para analizar el transcriptoma, para poder coger todas las fases de
lectura
+SOLID: el proceso inicial es igual: se fragmentan las
secuencias y se unen los adaptores para unirse a las bolas que son específicas
para una sola secuencia. Se hace PCR y se obtiene un tamaño de una micra. La reacción se secuenciación es pos ligación:
en vez de añadir un nucleótido se añade un fragmento de 8 nucleotido. Este
fragmento consta de: dos nucleótidos específicos, tres degenerados y tres que
comprenden todas las posibilidades. Después se une al fluoroforo. Se hibridan los dos primeros y los tres
siguientes van a dar fortaleza para mantener esto unido. Cuando esto está
unido, sabemos que en la secuencia que tenemos, las dos primeras corresponden
con nuestro oligonucleótido construido. De esta forma, cada base se está
secuenciando dos veces con el fluoroforo de antes y el de después. De esta
forma, una misma secuencia esta mapeada con dos fluoroforos y muchas veces de
forma que se está seguro de que esa secuencia es así. Esto es útil para hacer
haplotipos y localizar SNPs.
(Imagen tomada de http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=10 )
Ahora se hace un tratamiento quimico que elimina el
fluoroforo y los nucleótidos al azar. De esta forma, tenemos nuestros dos
nucleótidos de interés y tres nucleótidos degenerados. El problema es que como
estamos secuenciando dos a dos, hay problemas cuando faltan dos pb.
+Illumina: es la más usada. No necesita unirse a una
bola y no se hace una PCR de emulsión (en aceite). La secuencia se une a una
placa de secuenciación de tal forma que reconoce un adaptador al azar. Al tener
una secuencia complementaria, se forma un puente y se une a otro adaptador.
Esto se elonga en una PCR de forma que tenemos dos cadenas de una secuencia
localizadas en una región concreta. Se separa el puente y se tienen dos
secuencias iguales. Se suelen formar clusters de secuencias únicas a lo largo
de toda la placa. Esta tecnología se
basa en unos terminadores reversible de forma que una vez medida la
fluorescencia, se puede eliminar.
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| Imagen de http://seqanswers.com/forums/images/content/ilmn-step1-6.jpg |
Y se iniciaría el siguiente ciclo de secuenciación. El
problema es que aparezcan sustituciones. Es el más usado y el más barato en
coste pero no sirve del todo bien para el transcriptoma.
Third
generation sequencing technologies
+Ion Torrent: no va en base a fluorescencia.
Esta basada en la química. No se va a identificar la luz de un fluoroforo cada
vez que se incorpora a la secuencia si no que se va a ver un cambio de pH. Se
añade nucleótido y se libera un protón
por cada nucleótido y n veces por cada secuencia en cada bola. Por lo
tanto, la diferencia de pH es lo que se va a medir. Esta diferencia de pH lo
detecta un sensor que genera una diferencia de potencial. Después de medir la
química, se hace un lavado y se empieza de nuevo. Esto se ha usado mucho para
la secuencia de novo, resecuenciación, paleogenomica, transcriptoma, análisis
de variabilidad genética, epigenetica, regulación génica a gran escala.
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| Imagen de http://www.iontorrent.com/lib/images/step1.jpg |
sábado, 24 de diciembre de 2011
Feliz Yodidad a todos
Que la fuerza os acompañe...
...estas Navidades
Feliz Yodidad por María Pilar Vesga Aguado se encuentra bajo una Licencia Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
martes, 22 de noviembre de 2011
Resumen Seminario Metagenómica de virus de la Antártida.Alberto Lopez-Bueno. Facultad de Biología UAM.
METAGENÓMICA
DE VIRUS EN LA ANTÁRTIDA. Alberto Lopez-Bueno. UAM
La metagenómica es un conjunto de técnicas
basado en la secuenciación masiva que permite el estudio de microorganismos en
su ambiente natural sin necesidad de cultivarlos. Esto ultimo es muy importante porque muy
pocos microorganismos crecen en sistemas de cultivo de laboratorio, menos de un
1%. Por lo tanto, se sacaban conclusiones precipitadas.
Para dar respuesta a esta carencia nace la
metagenómica que tiene, frente a la genómica, la ventaja de tener una
información del 100% de los microorganismos de un medio. El estudio del 100% es
importante porque las bacterias y otros microorganismos son las principales de
los procesos más importantes del planeta y en todos los ambientes.
Por otra parte, alrededor de 100 billones de
bacterias viven en nosotros (10 veces más que células humanas) y contienen 100
veces más genes que el genoma humano. Además, nos permite conocerlas y usarlas
en ciertos procesos como los de biorremediación, funciones protectoras y de
aumento de eficiencia en cultivos vegetales. Por último la producción de
biocombustibles.
La historia de la virología se ha concentrado
en el estudio de virus que nos afectan directa o indirectamente por lo que
nuestro conocimiento es mínimo. El detonante para aumentar los horizontes fue
el inicio de la fluorescencia que nos
permitió observar que los virus son las entidades biológicas más abundantes y
diversas del planeta.
Los virus no solo regulan la composición si
no la cantidad de las comunidades de los diferentes microorganismos porque
hacen presión sobre los componentes de el sistema modificando su composición.
Esto es porque son específicos, en los genomas de las bacterias hay profagos
(ciclo lisogénico) insertados. Por otra parte, existe la transferencia
horizontal de genes, como por ejemplo la mayor de los virus que infectan
cianobacterias en los océanos contienen genes fotosínteticos y los virus les
transfieren genes nuevos para la fotosíntesis.
Una cosa curiosa es que los virus pueden
afectar al clima porque los virus infectan ciertas algas que al morir liberan
gas a la atmosfera (DMS) que actua como agente formador de nubes.
¿Qué es un metagenoma? Extracción de ADN o
ARN total de una comunidad de microorganismos procarioticos y virus que se
separan por filtración o centrifugación.
De estos filtros obtenemos microbiomas o viromas dependiendo del tamaño
del filtro.
A continuación hay que fragmentar el DNA
(enzimas de restricción, shotgun, etc) y se clonan en plásmidos, fasmidos,
BACs, etc. El DNA es captura o clonado y se secuencia (sanger,
pirosecuenciación o ultrasecuenciación).
El problema es analizarlos porque se
descargan millones de secuencias por lo que aquí entra en juego la
bioinformática que permite el ensamblaje y la comparación con bases de datos.
El ensamblaje consiste en construir, a partir de secuencias pequeñas,
contigs. Tambien es necesario comparar
con bases de datos para averiguar la taxonomía de especies del ecosistema y las
funciones que están codificadas por esos microorganismos o a que está dedicado
el ecosistema.
Esto ha dado lugar a un gran número de
proyectos basados en metagenómica para descubrir nuevos microorganismos y su
función en el medio. El primer metagenoma de virus se hizo en el 2006 donde se
estimo una gran diversidad. En ese momento, había muy pocos virus secuenciados
en la base de datos.
Lo más impactante es que la mayoría de esas
secuencias eran desconocidas, es decir, no se parecían a nada que estuvieran en
la base de datos. Esto es un atisbo de todo lo que nos queda por conocer,
incluidos, virus endógenos del cuerpo humano.
Lo sorprendente, es que incluso siendo la población bacteriana muy
similar entre gemelos monocigoticos, la población vírica es muy diferente.
En la Antártida se comienzan a caracterizar
unos lagos con ecosistemas muy sencillos de forma que es un sistema modelo para
estudiar como los virus controlan el ecosistema mediante su influencia en la
composición del ecosistema. Como la Antártida se separó hace muchos millones de
años y permanece aislada por una serie de corrientes y vientos de forma que se
dificulta el intercambio de vida; es un buen lugar para buscar organismos
endémicos y con características especiales. Por todas estas condiciones, los organismos se
podrían haber adaptado a estas condiciones tan extremas cosa que es interesante
para el estudio. Sin embargo la afluencia de turismo, el
calentamiento global y el agujero de ozono está poniendo en peligro este
ecosistema único haciendo que se derritan y desintegren partes del mismo.
El estudio se centra en la Peninsula de Byers
en la isla Livingston que en ciertas épocas del año permanece sin hielo. Es una zona de especial protección porque es
el principal asentamiento de elefantes marinos y pingüinos por lo que el
impacto de la presencia del hombre tiene que ser mínima.
La zona más interna, más aislada del mundo
exterior, es un mundo con muy poca vida pero la retirada de hielo deja al
descubierto riachulos y lagos. Debajo de la capa de hielo hay 5 m de agua
líquida y se recogen muestras de agua tanto cuando hay hielo como cuando no lo
hay. Con las muestras se hace un preprocesado:
filtrado de los virus y concentrado. Estas muestras se llevaron al cbm donde se
concentraron aun más. Estos stocks de virus concentrados son los que se han
utilizado para el estudio.
Por una simple microscopia se pudieron
encontrar diferentes tipos de virus y fagos;incluso algunas estructuras que no
se sabe si quiera si son virus o no. Con esto se clasifican y se observan las
diferencias entre primavera (dominado por partículas virales pequeñas) y verano
(partículas virales grandes).
A continuación se lleva a cabo un tratamiento
con nucleasas para eliminar el DNA que no está protegido. A continuación se
amplifica al azar y secuencia. Por último se hizo un análisis del que se
compararon todos los virus encontrados. La inmensa mayoría de las secuencias
eran desconocidas. Las conocidas fueron clasficadas en 12 familias, cosa
curiosa porque era una cantidad de familias muy diversa en comparación con otros
medios como el mar u otros lagos.
Gracias a esto se pudo establecer la cantidad de especies presentes en
ese lago a diferencia de lo que se podía pensar en un principio ya que era un
ecosistema muy sencillo.
Un grupo de virus que interesó fueron los
Phycodnavirus que infectan algas y son los dominantes en verano. Esto está en
concordancia con que en verano, había un bloom de algas, por lo que en el
estudio salió como virus mayoritario.
Se pudo obtener información acerca de la
polimerasa de este virus lo que ha dado lugar a un nuevo horizonte en
secuenciación en frio, cosa que no pueden hacer las polimerasas utilizadas en
laboratorio. El problema es que tendría
que tener una alta afinidad.
Por otra parte, los genomas más pequeños sí
que pudieron ser completados dando lugar a semejanzas y diferencias con los
virus conocidos. Las diferencias dieron lugar a pensar que se encontraron virus
de una familia nueva que es la realmente dominante en el lago limnopolar.
Seminario impartido por Alberto Lopez-Bueno
sábado, 19 de noviembre de 2011
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