He aquí mi resumen sobre el trabajo original Tasic B, et al. (2011) Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proc Natl. No he incluído los dibujos del trabajo por razones obvias. Enjoy it

TRANSGENESIS DE SITIO ESPECÍFICO MEDIADA POR INTEGRASAS VÍA INYECCIÓN PRONUCLEAR

1.- Introducción

Durante muchos años se ha llevado a cabo la producción de ratones transgénicos mediante inyección pronuclear. Esto consiste en la fecundación de un óvulo por un espermatozoide de forma que se obtiene un cigoto con dos pronúcleos. Mediante microinyección se le introduce el DNA de interés al pronúcleo masculino (más grande) y se inserta en una hembra pseudopreñada.

Mediante un Southern Blot o una PCR, podemos detectar en la descendencia aquellos individuos que han incorporado el fragmento. Sin embargo, no siempre lo incorporan en todas las células si no que puede existir una inserción tardía del fragmento de forma que sólo lo presenten algunas células del individuo adulto. Cuando lo haya incorporado en la línea germinal habrá que cruzarlo con la F0 y, posteriormente su descendencia, con los individuos de la F1 para obtener algunos individuos homocigotos para este transgen.

Sin embargo, con esta técnica pueden surgir problemas con el efecto de posición, además, de que es muy poco eficiente. El efecto de posición es la situación en la que la expresión fenotípica de un gen se altera al cambiar la posición en el genoma (2), en este caso, debido a la introducción del material exógeno.

Debido a esto, como resultado, pueden obtenerse ratones cuyo fenotipo no es el que deseamos porque el gen de interés ha podido insertarse en cualquier lugar del genoma de forma que los datos obtenidos pueden estar condicionados por efectos inesperados de la inserción.

Para abordar el problema de la inserción aleatoria del gen, es necesaria la recombinación homóloga con un lugar específico del genoma. Sin embargo, la eficiencia de este proceso, es realmente baja. Una solución para este problema son las integrasas, unas enzimas que insertan un gen en un lugar determinado de un sistema heterólogo. Esta propiedad ha sido clave para este estudio donde se ha empleado la integrasa del fago φ31 que reconoce sitios attP previamente insertados en el genoma del huésped.

2.- Desarrollo del experimento

La integración específica de sitio tiene como base teórica la inserción del fago λ en el genoma del huésped a partir de los sitios att lo que implica una recombinación sin que sea necesaria la presencia de secuencias homólogas. Para ello es necesario que en el huésped tengamos un sitio attB y en el fago un sitio attP de forma que la integrasa pueda reconocerlos y actuar de una forma muy similar a la de la topoisomerasa. (3)

En este experimento se usa la integrasa del fago φ31 por lo que es necesario generar embriones que contengan sitios attP. Para ello, se utiliza la recombinación clásica en células ES de ratón. Las células ES son células madre obtenidas del blastocisto de un ratón que van a ser transfectados e insertados en una hembra pseudopreñada. Después, habrá que realizar cruzamientos para obtener los individuos homocigótos para estos sitios attP.

Los experimentos se realizaron con una única copia de attP o con tres aunque, a pesar de que en un principio pudiera parecer lo contrario, la eficiencia de inserción es aproximadamente igual en los dos tipos de embriones.

En el estudio se probaron dos sitios de inserción de estos sitios attP para la integración: Rosa26 e Hipp11. El sitio Rosa26 soporta la expresión de una sola copia de un gen Knock-in con un enhancer CMV (virus del mosaico de la coliflor) y un promotor ubicuo pCA (promotor de la β-actina de pollo). Por otra parte, H11 soporta alto nivel de expresión génica del promotor pCA y una alta tasa de recombinación mitótica comparado con Rosa26. Por lo tanto, se concluyó que H11 va a permitir un mejor acceso a la integrasa que Rosa 26 además de que Hipp11 soporta una mayor expresión de trangenes integrados. Los experimentos resultantes de la inserción de transgenes en este locus H11 no predicen la ruptura de ningún gen endógeno y resultan en ratones fértiles y sanos.

Una vez que se obtienen embriones homocigotos para attP, se realiza una coinyección de un miniDNA circular pcA-pattB-GFP (el GFP nos sirve como gen reportero) con un mRNAφ31o (mRNA de la integrasa optimizada para mamíferos) obteniendo una alta tase de inserción. Además, las inserciones en sitios aleatorios son muy raras y la inclusión de más de una copia es muy poco común. Por último, este método puede ser específico de tejido si le incluímos un promotor de dicho tejido. Por ejemplo, introdujeron Hb9 obteniendo unos resultados favorables.

Sin embargo, antes de llegar a esta conclusión se realizaron otros experimentos para determinar si el plásmido completo influía en la expresión del gen reportero y para averiguar si se obtenía la misma eficiencia insertando la integrasa específica en el genoma.

En cuanto al primero, se hicieron experimentos para observar si la introducción del esqueleto (backbone) del plásmido en los sitios específicos afectaba a la eficiencia de integración. Observaron que la eficiencia disminuía por lo que concluyeron que debían de utilizar sólo el miniDNA circular, preferentemente, o un DNA con el backbone pero con dos sitios attB para que sólo se integrara el fragmento de interés como vemos en la figura. En este último caso, la integrasa cataliza a una recombinasa para el intercambio del cassette de genes.

El segundo, se obtuvieron embriones homocigotos para Hipp11-attP3-NVφ (gen Hip11 con sitios attP, gen de resistencia a neomicina, promotor VASA de la expresión germinal y gen de la integrasa φ31o). A estos embriones se les inyectó el microDNA circular attB-pCA-GFP obteniéndose como resultado que no había una buena tasa de integración. A continuación se coinyectó a estos embriones con mRNA φ31o aumentándose mucho dicha tasa. Esto se dedujo que debía deberse a que VASA no es un promotor suficientemente fuerte.

Por lo tanto, se decidió eliminar el backbone del plásmido y el cassette NVφ del experimento ya que su presencia sólo dificultaba la integración y disminuía la tasa de inserción.

3.- Conclusiones

El hecho de que una vez que se obtienen individuos con sitios attP insertos en el lugar correcto, se puedan introducir fragmentos de DNA con una alta probabilidad, abre muchas puertas a la terapia génica e ingeniería genética. Esto es debido a que este método es, considerablemente, más sencillo y efectivo que la recombinación homóloga en células ES de ratón y la microinyección en pronúcleos para una recombinación aleatoria.

No sólo implica la disminución del tiempo empleado en la obtención del transgénico deseado si no que supone una ventaja a nivel económico y ético. Esto es debido a que al tenerse que emplear menos individuos para obtener resultados favorables hay un ahorro económico en su obtención y mantenimiento y se sacrifican menos animales.

Las diferencias generadas en los niveles y patrones de expresión debido al efecto de posición y difererencias en el número de copias insertadas aleatoriamente, son eliminadas con este método de transgénesis específica.

Existen otros métodos modernos como por ejemplo el dedo de Zinc que crea sitios específicos de recombinación; y la utilización de la recombinasa Cre para catalizar el intercambio de cassettes de genes en el locus Rosa26.

Un desarrollo futuro podría usar dos parejas de attB y attP no compatibles para controlar la dirección de la inserción; o incluso plantear una inserción específica de varios fragmentos de DNA con varias funciones.

4.- Bibliografía

(1) Tasic B, et al. (2011) Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proc Natl

Acad Sci USA 108:7902–7907.

(2) Genética. Griffiths 7ª Edición. Pág 813 McGraw Hill

(3) Genes IX. Capítulo 19. McGraw Hill